一.简介

A.细胞名称：人胰腺癌细胞/吉西他滨耐药株（PANC-1/GEM）

B.细胞来源：胰腺，胰管，上皮细胞癌   

C.细胞形态：上皮细胞样，贴壁生长

D.细胞数量：>1百万个

E.污染检测：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

F.包装规格：T25培养瓶或者1ml冻存管包装

G.完全培养基：89%DMEM＋10%优质FBS＋1%双抗+18ug/ml GEM

H.细胞背景描述: 该人胰腺癌细胞PANC-1来源于一名56岁白人男性。1 U/ml 左旋天冬酰胺酶(L-asparaginase)可抑制其生长。此细胞可以在琼脂糖上生长。

J.细胞的发货方式：细胞发货运输可选择干冰运输或发送复苏存活细胞这两种方式

1. MTT法检测PANC-1对吉西他滨的IC50

将处于对数生长期的PANC-1细胞传代后，以6000/孔的密度接种在96孔板里，待细胞生长稳定后，将培养基更换为含不同浓度吉西他滨的完全培养基，浓度依次为0.03μg/mL、0.3μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、18μg/mL。置于含5%CO2、饱和湿度的37℃恒温细胞培养箱中培养72h。取出96孔板，每孔加入20ul MTT（5 mg/mL）溶液加入到每个培养孔中，继续培养4 h。4 h后，取出96孔板，吸除培养基，排枪每孔加入150 µL Formazan溶液，置摇床上低速振荡10-30min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在OD 570nm处测量各孔的吸光值，分析实验结果，得出IC50为0.9μg/mL，则选择此浓度作为PANC-1耐药株诱导的起始浓度。

2. PANC-1细胞耐药分步诱导

取处于对数生长期的PANC-1细胞，加入含0.9μg/mL吉西他滨的完全培养基，置于含5%CO2、饱和湿度的37℃恒温细胞培养箱中培养。隔日换液（同浓度含药培养基），待细胞可以稳定生长后加大药物浓度，每次增加2倍，直至10个月后，细胞可以在含18μg/mL吉西他滨的完全培养基保持稳定生长4day，视为细胞耐药成功，并命名为PANC-1/GEM。

二.收到细胞后的处理：

1）收到细胞后的拍照:请检查冻存管或培养瓶的状况，若发现干冰已挥发干净、冻存管或培养瓶瓶盖脱落、冻存管破损或培养瓶有破损漏液溢出及细胞有污染等现象，请立即拍照与我们联系。

2）收到细胞后的保存以及处理：A.若收到的是干冰运输的细胞，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏；B.若收到的是复苏存活的细胞，收到后应继续生长培养，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

3）在显微镜下检查细胞生长状态时，最好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，这样能够准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10×和20×物镜下，刚收到细胞时请立即给细胞拍照，（10×，20×）各拍照2-4张以及培养瓶外观拍照2-4张并留存，有必要时,这些照片可以作为日后售后的依据。

4） 观察完细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

5）贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书上写的新配置好的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。

6）悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出培养瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书上写的新配置好的完全培养基）。

7）注意：如果培养瓶装的是运输培养基（灌液培养基），是不能再用来培养细胞的，请换用按照说明书上写的新配置好的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议1：2传代 。

三.细胞培养操作

A.培养基及培养冻存条件：

1）完全培养基：89%DMEM＋10%优质FBS＋1%双抗+18ug/ml GEM。

2）细胞在传代和刚复苏时较为脆弱，中止液须为不含GEM的完全培养基，且在细胞未贴壁期间和贴壁前期需用不含GEM的完全培养基，待细胞生长状态稳定时再根据需要浓度添加 GEM。

3）若细胞生长状态较为缓慢时，可适当降低GEM的浓度，或使用不含GEM的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的GEM浓度。

4）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

5）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

B.复苏细胞、细胞传代、细胞冻存：

1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3） 细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

下面T25瓶为例；

1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X10⁶个细胞冻存。

3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。

注意事项：

1. 收到细胞后，请立即拍照；若发现干冰已挥发干净、冻存管或培养瓶瓶盖脱落、冻存管破损或培养瓶有破损漏液溢出及细胞有污染等现象，请立即拍照与我们联系。

2. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

3.细胞用途：仅供科研使用。