一.简介

A.细胞名称：人神经内分泌前列腺癌细胞（NCI-H660）

B.细胞来源：前列腺癌，淋巴结转移

C.细胞形态：上皮细胞样，悬浮生长，少量贴附。

D.细胞数量：>1百万个

E.污染检测：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

F.包装规格：T25培养瓶或者1ml冻存管包装

G.完全培养基：94% RPMI-1640＋5%优质FBS＋1%双抗+0.005 mg/ml 胰岛素+0.01 mg/ml 转铁蛋白+30nM 亚硒酸钠+10 nM 氢化可的松+10 nM beta-雌二醇 ，+2mM L-谷氨酰胺（推荐gibco货号：35050-061）

H.细胞背景描述: 该细胞来源于63岁成年高加索地区男性的前列腺癌细胞在淋巴结的转移灶。

J.细胞的发货方式：细胞发货运输可选择干冰运输或发送复苏存活细胞这两种方式

二.收到细胞后的处理：

1）收到细胞后的拍照:请检查冻存管或培养瓶的状况，若发现干冰已挥发干净、冻存管或培养瓶瓶盖脱落、冻存管破损或培养瓶有破损漏液溢出及细胞有污染等现象，请立即拍照与我们联系。

2）收到细胞后的保存以及处理：A.若收到的是干冰运输的细胞，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏；B.若收到的是复苏存活的细胞，收到后应继续生长培养，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

3）在显微镜下检查细胞生长状态时，最好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，这样能够准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10×和20×物镜下，刚收到细胞时请立即给细胞拍照，（10×，20×）各拍照2-4张以及培养瓶外观拍照2-4张并留存，有必要时,这些照片可以作为日后售后的依据。

4） 观察完细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

5）贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书上写的新配置好的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。

6）悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出培养瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书上写的新配置好的完全培养基）。

7）注意：如果培养瓶装的是运输培养基（灌液培养基），是不能再用来培养细胞的，请换用按照说明书上写的新配置好的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议1：2传代 。

三.细胞培养操作

A.培养基及培养冻存条件：

1） 完全培养基：94% RPMI-1640＋5%优质FBS＋1%双抗+0.005 mg/ml 胰岛素+0.01 mg/ml 转铁蛋白+30nM 亚硒酸钠+10 nM 氢化可的松+10 nM beta-雌二醇 ，+2mM L-谷氨酰胺（推荐gibco货号：35050-061）

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

B.复苏细胞、细胞传代、细胞冻存：

1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，离心管加入4mL培养基混合均匀。在800-1000RPM条件下离心4-5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入T25培养瓶中培养，补加培养基至6ml。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%，即可进行传代培养。

1. 将细胞悬液按1：2到1:5比例分到新皿中或者瓶中，补加培养基至6ml，放入培养箱继续培养。

3）细胞培养：随着细胞数量的增加添加培养基来维持细胞的生长，轻摇培养瓶可使附着细胞重新悬浮。单个细胞容易死亡，成团（成簇）细胞更容易生长，当细胞生长过程中出现数量很多悬浮的细胞（团）时 要进行传代。

4）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1，细胞冻存时，取上清，可使用血球计数板计数。

2，4min ，1000rpm 离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度1-2xE6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。

注意事项：

1. 收到细胞后，请立即拍照；若发现干冰已挥发干净、冻存管或培养瓶瓶盖脱落、冻存管破损或培养瓶有破损漏液溢出及细胞有污染等现象，请立即拍照与我们联系。

2. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

3.细胞用途：仅供科研使用。