一.简介
A.细胞名称：小鼠胚胎干细胞（ES-E14TG2a ）
B.细胞来源：小鼠，129/Ola品系,胚胎内细胞团
C.细胞形态：球形克隆 贴壁生长
D.细胞数量：>1百万个
E.污染检测：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性
F.包装规格：T25培养瓶或者1ml冻存管包装
G.完全培养基：81%DMEM＋15%优质FBS＋1%L-谷氨酰胺+1% NEAA非必需氨基酸+1%Sodium Pyruvate丙酮酸钠+1%双抗+ 1ul/mlβ-巯基乙醇+0.1ul/ml LIF
H.细胞背景描述: 小鼠胚胎干细胞。该细胞缺乏 HGPRT（HPRT），并且对 0.06 mM 的 6-硫鸟嘌呤有抗性。当在饲养层（胚胎成纤维细胞或 STO 细胞）上培养时，细胞保持未分化状态。在没有饲养层的情况下，细胞自发分化并形成胚胎结构。当注入胚泡中时，细胞可以进入生殖系。在常规的分子基因修饰技术之后，它们可用于重构小鼠胚胎。培养时需使用昆明白MEF作为饲养层细胞。
J.细胞的发货方式：细胞发货运输可选择干冰运输或发送复苏存活细胞这两种方式
Smith AG, Hooper ML. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev. Biol. 121:1-9,1987. PubMed: 3569655
Kuehn MR, et al. A potential animal model for Lesch-Nyhan syndrome through introduction of HPRT mutations into mice. Nature 326: 295-298, 1987. PubMed: 3029599
Doetschman T, et al. Targetted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature 330: 576-578, 1987. PubMed: 3683574
二.收到细胞后的处理：
1） 收到细胞后的拍照:请检查冻存管或培养瓶的状况，若发现干冰已挥发干净、冻存管或培养瓶瓶盖脱落、冻存管破损或培养瓶有破损漏液溢出及细胞有污染等现象，请立即拍照与我们联系。
2)收到细胞后的保存以及处理：A.若收到的是干冰运输的细胞，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏；B.若收到的是复苏存活的细胞，收到后应继续生长培养，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。
3） 在显微镜下检查细胞生长状态时，最好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，这样能够准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10×和20×物镜下，刚收到细胞时请立即给细胞拍照，（10×，20×）各拍照2-4张以及培养瓶外观拍照2-4张并留存，有必要时,这些照片可以作为日后售后的依据。
4） 观察完细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。
5） 贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书上写的新配置好的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。
6） 悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出培养瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书上写的新配置好的完全培养基）。
7）注意：如果培养瓶装的是运输培养基（灌液培养基），是不能再用来培养细胞的，请换用按照说明书上写的新配置好的完全培养基来培养细胞。 收到细胞后第一次传代建议1：2传代 。
三.细胞培养操作
A.培养基及培养冻存条件：
1）完全培养基：81%DMEM＋15%优质FBS＋1%L-谷氨酰胺+1% NEAA非必需氨基酸+1%Sodium Pyruvate丙酮酸钠+1%双抗+ 1ul/mlβ-巯基乙醇+0.1ul/ml LIF培养瓶用0.1%明胶包被，或者使用昆明白MEF作为饲养层细胞。
2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：完全培养液 60%%，FBS 30%%，DMSO 10%%现用现配。
我库冻存时，体积为 500 μl，预期存活率 70%，每支冻存管的细胞复苏，3 至4 天后，会形成 30 至 40 个克隆，建议复苏至 1 个 T25 培养瓶中。
B.MEF 细胞铺制、复苏细胞、细胞传代、细胞冻存：
1. 在 T25 培养瓶中加入 0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于 37℃细胞培养箱至少放置 15 min 以上。
2. 吸除 0.2%明胶，加入事先水浴加热至 37℃的 MEF 完全培养液。一般地，一个 T25 培养瓶中加入 5 ml MEF 完全培养液。
3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；复苏 MEF 细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用 75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
4. 将冻存管内细胞悬液转移至含 2 ml MEF 完全培养液的 15 ml 离心管内，以1000 rpm，离心 5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的 MEF 完全培养液 1 ml，重悬后按照一个 T25 培养瓶铺 1´106 的 MEF 细胞，平均加入到 T25 培养瓶中，轻轻摇匀后置于 37℃细胞培养箱。24 h 以后可以传入小鼠胚胎干细胞
5.复苏或传代小鼠胚胎干细胞前，将 T25 培养瓶中的 MEF 完全培养液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞完全培养液待用。
1.将小鼠胚胎干细胞冻存管从液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用 75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
2. 将冻存管内细胞悬液转移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液的 15 ml 离心管内，以 1000 rpm，离心 5 min。
3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞完全培养液 2 ml，吹打悬浮。
4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
5. 转移至 1 个已经铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中培养。
6. 每天更换小鼠胚胎干细胞完全培养液。
传代：
1. 一般在复苏后第 2-3 天传代，视克隆大小和密度而定
2. 吸除废液。
3. 用 PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于 37℃培养箱内消化细胞。
5. 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要 1-2 min）。
6. 加 2 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液终止消化。
7. 以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清。
8. 加入约 1 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞， 制成单细胞悬液。
9. 加入足量的小鼠胚胎干细胞完全培养液，吹打混匀，细胞悬液分装到铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中。一般地，一个 T25 培养瓶加入 5-6 ml 培养液。放入 37℃培养箱内培养。每天换液。传代比例：1:4-1:7
1.按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
2. 以 1000 rpm，离心 5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
3. 按每支存管内加入 500 ml 细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
4. 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。冻存液配方：
小鼠胚胎干细胞完全培养液 60%，ES 级 FBS 30%，DMSO 10%
1.培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞， 吹打混匀，细胞悬液分装到无 MEF 细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25 培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个 10 cm 培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与 MEF 细胞）中。
2. 培养皿或培养瓶置于 37°C 培养箱内静置 1 小时。
3. 1 小时后，绝大部分 MEF 细胞已贴在培养皿或培养瓶底面，而大部分小鼠胚胎干细胞仍然悬浮在培养液中。收取培养液，进行后续实验。
注意事项：
1. 收到细胞后，请立即拍照；若发现干冰已挥发干净、冻存管或培养瓶瓶盖脱落、冻存管破损或培养瓶有破损漏液溢出及细胞有污染等现象，请立即拍照与我们联系。
2. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
3.细胞用途：仅供科研使用。
1. 收到细胞后，请立即拍照；若发现干冰已挥发干净、冻存管或培养瓶瓶盖脱落、冻存管破损或培养瓶有破损漏液溢出及细胞有污染等现象，请立即拍照与我们联系。
2. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
3.细胞用途：仅供科研使用。
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